y
Vírusy – I. diel
Z pomedzi tých, ktorí sa snažili nájsť a podať vedecký výklad o povahe utajených pôvodcov niektorých chorôb bol najúspešnejší ruský bádateľ Ivanovskij. Roku 1892 zistil, že šťava z listov mozaikového tabaku je infekčná aj po prefiltrovaní bakteriálnym filtrom, ktorý zadržiava, neprepúšťa baktérie. Dokázal tak existenciu aj iných pôvodcov chorôb než sú baktérie a huby. Pôvodcov tejto choroby nazval vírusmi. Ivanovskij svoju prácu o filtrovateľných vírusoch ďalej rozpracoval a v roku 1902 publikoval. Aj keď bola podstata vírusov opísaná len nedokonale, predsa boli a ešte aj dnes sú jeho práce základom nového vedného odboru nazvaného virológia. Ivanovskij je právom považovaný za zakladateľa tejto vednej disciplíny. Ivanovskij došiel so svojou prácou v dobe, keď bola bakteriológia na vrchole svojej slávy a popularity, našiel viacero odporcov a v prvých dvoch desaťročiach nášho storočia si jeho práce len pomaly razili cestu. Rozmach virológie začína vlastne až po prvej svetovej vojne.
Na obrázku je rastlina tabaku, napadnutá vírusom mozaiky tabaku. S touto chorobou pracovalo už v minulom storočí veľa bádateľov svetového mena, ale nepodarilo sa im izolovať pôvodcu ochorenia. Aj pre Ivanovského bola záhadou, no po niekoľkých rokoch vytrvalej a cieľavedomej práce mu poskytla dostatok materiálu na to, aby vytvoril teóriu o celkom novom type pôvodcov choroby než s akým pracovali v celom svete uznávaní bakteriológovia. Už vtedy bola choroba rozšírená vo všetkých oblastiach sveta, kde sa pestoval tabak. Prvé práce s vírusmi sa robili takmer výhradne na tabaku a s vírusom mozaiky tabaku. Aj dnes je tabak a vírus mozaiky tabaku modelovým, klasickým objektom virológie. Rastlina, napadnutá vírusom mozaiky tabaku zaostáva vo vzraste, na listoch sú nepravidelné jasnozelené a tmavozelené škvrny, čím vzniká pestré, mozaikové vyfarbovanie čepele listov dosť často spojené s deformáciou tvaru a povrchu listov. Čím je nakazená rastlina mladšia, tým dochádza k silnejšiemu ochoreniu, k výraznejším zmenám.
Na chorých rastlinách vznikajú tiež anatomické zmeny v pletivách rastúcich listov. Deformuje sa palisádový parenchym, zmenšuje sa počet a veľkosť chloroplastov, porušuje sa ich štruktúra a vyfarbenie. Ivanovskij venoval veľkú pozornosť štúdiu anatómii a fyziológii rastlín, napadnutých vírusom mozaiky. Došiel k viacerým novým poznatkom, z ktorých mimoriadne významné bolo objavenie takzv. inklúzií v bunkách chorých rastlín. Dal ich do súladu s ochorením. Tieto inklúzie vznikajú v cytoplazme buniek. Sú to zhluky rôzneho tvaru /beztvaré, kryštalické, smyčkovité, vretenovité, ihlicovité, cigárovité a pod./, ktoré sa v bunkách zdravých rastlín nevytvárajú. Preto Ivanovskij už roku 1902 správne usúdil, že nález inklúzií v rastlinných bunkách môže byť dobrou pomôckou pri určovaní choroby. Neskôr objavili inklúzie aj u viacerých vírusových chorôb živočíchov a hmyzu.
U viacerých vírusov bolo už dávnejšie známe, že po ich vyčistení a skoncentrovaní sú za určitých okolností schopné vykryštalizovať, vytvoriť určité pre ten druh typické kryštály. Na obrázku sú osemstenné kryštály vyčisteného vírusu žltej mozaiky kvaky. Iné, ale nie všetky vírusy vytvárajú kryštály iných tvarov.
V čase objavenia existencie vírusov bola mikroskopická technika dostatočná na to, aby plne vyhovovala požiadavkám bakteriológov. Svetelné mikroskopy, aj dnes používané v školách a laboratóriách, umožňujú vidieť objekty o veľkosti až jednej stotiny milimetra, maximálne jednej tisíciny milimetra. Drobnejšie objekty, ako sú napríklad vírusy, nie je možné vidieť v týchto svetelných mikroskopoch. Ivanovskij nemohol vidieť vírusy a veda potrebovala čas, aby zostrojila a zdokonalila princíp mikroskopu, ktorý by mal ďaleko väčšiu rozlišovaciu schopnosť než svetelný mikroskop. Na osvetlenie objektu nemohli použiť slnečné alebo umelé svetlo, ktoré má pomerne dlhé vlny, dlhšie než veľkosť vírusov. V novom, elektrónovom mikroskope, ktorý vidíte pred sebou, sa používajú elektrónové lúče o veľmi krátkych vlnách. Namiesto sklenených šošoviek sú v tomto mikroskope šošovky vytvorené magnetickým poľom a celý systém pracuje vo vákuu, vo vzduchoprázdne. Takýto elektrónový mikroskop umožňuje pozorovať ďaleko menšie objekty než svetelný mikroskop. Elektrónový mikroskop sa stal veľkým pomocníkom virológov. Umožnil im nielen vidieť tvary vírusov, zmerať ich veľkosť, ale aj študovať ich stavbu.
Ivanovskému bolo jasné, že vírusy sú menšie baktérie, ale nemal bližšej predstavy o ich veľkosti. V ďalších výskumoch využitím fyzikálnych metód pri výskume vírusov, ale hlavne už predstaveného elektrónového mikroskopu, bolo možné spresniť predstavy o veľkosti i tvare vírusov. Na obrázku trojuholníkový výsek predstavuje polomer ľudskej červenej krvinky. V tomto výseku hore je znázornená veľkosť drobnej baktérie. Tmavá plocha v tejto drobnej baktérie predstavuje rickettsiu – organizmus veľkosťou a stavbou medzi baktériami a vírusmi. Potom smerom dolu nasledujú jednotlivé druhy vírusov. Vírus mozaiky tabaku, o ktorom sme už hovorili a s ktorým pracoval Ivanovskij, je šiesty zdola a má tvar paličky alebo tyčinky. Posledná bodka v trojuholníkovom výseku červenej krvinky predstavuje molekulu bielkoviny vajca – albumín.
Vráťme sa ešte ku inklúziam. Elektrónový mikroskop umožnil odhaliť, že Ivanovskijom objavené a opísané inklúzie amorfného, kryštalického alebo iného tvaru v cytoplazme alebo v jadre buniek sú vlastne zhluky hotových vírusových častíc. Vírusy v tejto forme pretrvávajú dlhší čas, sú nečinné. Za určitých okolností sa inklúzie rozpadávajú, vírusy sa uvoľňujú a môžu byť aktívne, infekčné. Sledovanie rezov inklúzií v elektrónovom mikroskope umožnilo zistiť, že usporiadanie vírusov v inklúziach má svoje pravidlá. Na obrázku vidíte rez kryštalickou inklúziou vírusu mozaiky tabaku. Vírusové častice tyčinkovitého tvaru sú akoby naukladané vedľa seba, vytvárajú rady a tieto sú tiež tesne jeden vedľa druhého.
Pozrime sa teraz bližšie na tvary a stavbu niektorých druhov vírusov. Takmer všetky známe vírusy sú škodlivé. Napadajú živé bunky organizmov, od baktérií až po najväčšie živočíchy, využívajú bielkovinové látky buniek na stavbu vlastných častíc. Tým spôsobujú menej alebo viacej vážne zmeny vo funkcii napadnutých buniek, čo vedie k určitému typu ochorenia. Na obrázku vidíme vírusovú časticu vírusu mozaiky tabaku. Sú to rovné tyčinky, široké asi 15 nanometrov /nm – jeden nm je tisícina mm/ a dlhé asi 280 nm. Vírusová častica mozaiky tabaku je veľmi odolná voči vysokým i nízkym teplotám, voči vysušeniu, v suchých listoch nestratí infekčnosť ani po 10–20 rokoch, vo vode alebo v šťave vydrží tiež veľmi dlho, až niekoľko rokov. Je to jeden z najvytrvalejších vírusov, je schopný nakaziť mnohé druhy rastlín z rôznych čeľadí. Najviac prác vo virológii sa urobilo práve s týmto vírusom. Právom ho možno nazvať klasickým vírusom.
K tyčinkovitým vírusom sú blízke vírusy vláknitého tvaru. Sú približne tak hrubé ako tyčinkovité vírusy, ale sú dlhšie /dvoj až štvornásobne/ a sprehýbané. Nie sú tak tuhé, sú ohybné. Štruktúra ich stavby, o ktorej si za chvíľu povieme viac, je rovnaká ako u tyčinkovitých vírusov. Na obrázku sú častice vírusu čiarkovitosti zemiaka, nazývaného tiež Y vírusom. Ide tiež o vírus rozšírený v celom svete a hospodársky významný, lebo spôsobuje vážne ochorenie zemiakov. Vírus prenášajú rôzne druhy vošiek. Je oveľa citlivejší na vyššie teploty. V suchých listoch, v šťave, v pôde, stráca oveľa rýchlejšie svoju nákazlivosť než vírus mozaiky tabaku.
Mnohé vírusy sa podarilo nielen vidieť, zobraziť tvar a zmerať veľkosť ich častíc, ale aj vniknúť do vnútornej štruktúry ich stavby, rozložiť ich na jednotlivé stavebné zložky. Je bezpečne dokázané, že všetky vírusové častice pozostávajú zo zložených makromolekulových bielkovín, tzv. nukleoproteidov. Rastlinné vírusy sú v porovnaní so živočíšnymi jednoduchšie. Skladajú sa zvyčajne z jedného druhu bielkoviny /proteinu/ a z kyseliny ribonukleovej. Len málo rastlinných vírusov má dezoxyribonukleovú kyselinu. Na obrázku máme náš klasický vírus mozaiky tabaku, resp. kúsok z jeho tyčinkovitej častice. Ribonukleová kyselina je označená písmenami RNK. Ona je nositeľkou infekčnosti, nákazlivosti. Je ako oceľová špirála, pozostáva z niekoľkých tisíc článkov – nukleotidov a je umiestnená vo vnútri tyčinky. Ribonukleová kyselina je chránená bielkovinným /proteínovým/ neinfekčným, nenákazlivým obalom. Na obrázku je vidieť priestorové usporiadanie bielkovinových jednotiek. Bielkovinový obal vírusu mozaiky tabaku pozostáva asi z 2100 bielkovinových subjednotiek. Každá bielkovinová subjednotka vírusu tabaku pozostáva zo 158 aminokyselinových zvyškov. Pomer nukleovej kyseliny a bielkoviny je u každého vírusu iný. Nukleová kyselina robí 5 až 40% z vírusu a bielkovina predstavuje zbytok, t. j. 60–95%. Nižší obsah nukleovej kyseliny sa nachádza pri trubičkovitých vírusoch, vyšší obsah u guľovitých vírusov. Prostriedok vírusovej častice, tyčinky alebo vlákna je prázdny, takže môžeme hovoriť o trubičkovitých /tubulárnych/ vírusoch.
Viacero rastlinných ale aj živočíšnych vírusov má sférické či guľovité častice o veľkosti 17 až 60 nm, prípadne aj väčšie. Na obrázku hore sú vírusové častice žltej mozaiky okrúhlice, dolu vírusové častice pri oveľa väčšom zväčšení mozaiky arábky.
Iba veľmi zriedka ide o guľovité častice, väčšinou ide o častice mnohostenné. Na obrázku je znázornená stavba mnohostennej častice vírusu. Jednotlivé guľôčky predstavujú kapsomery. Vírusová častica má celkom 252 kapsomerov, ktoré vytvárajú 20 stien. Na obrázku dolu vľavo je schématicky znázornená stavba bielkovinového plášťu častice vírusu mozaiky kvaky s 32 kapsomerami. Vpravo je priečny rez časticou so znázornením uloženia ribonukleovej kyseliny v bielkovinovom plášti.
Vírusy tejto skupiny sú stavané podľa ikosaedrickej symetrii. Majú všetky tri osi rovnako dlhé. U guľovitých rastlinných vírusov bielkovinové subjednotky sa zdajú byť usporiadané do rôznych štruktúr asi tak ako je to schématicky znázornené na tomto obrázku. Vírusová častica pozostáva zo 60 alebo niekoľkonásobku 60-tich subjednotiek, ktoré sú usporiadané v skupinách po 3, 5 alebo 6. Bielkovinové subjednotky sú pevne uložené v usporiadaní, ktoré dáva 20 alebo niekoľkonásobok 20-tich plošiek a vytvára ochranný plášť pre infekčnú nukleovú kyselinu. V tomto plášti alebo pod týmto plášťom je poskladaná alebo ináč organizovaná nukleová kyselina. Zatiaľ nie je známy presný spôsob uloženia a organizácie nukleovej kyseliny v guľovitých časticiach.
Niektoré vírusy majú častice rôznej veľkosti. Typickým príkladom je vírus mozaiky lucerny. Má častice paličkovitého, bacilovitého tvaru, ale o piatich dĺžkach a to 18, 30, 42, 53 a 59 nm. Všetky majú hrúbku asi 18 nm. Tieto veľkosti sa pravidelne dodržiavajú. Najväčšiu infekčnosť majú najdlhšie častice. Malú infekčnosť majú stredne veľké častice a častice najkratšie sú neinfekčné, nenákazlivé. Na obrázku je model stavby a štruktúry jednotlivých typov častíc. Tento vírus obsahuje pomerne veľa infekčnej ribonukleovej kyseliny a menej ochrannej bielkoviny.
Ďalšou skupinou vírusov sú takzv. veľké vírusy majúce okrem bielkovinového plášťa ešte ochranný obal či membránu. Pri vírusoch bacilovitého tvaru, napr. pri víruse žltej zakrpatenosti zemiaka je ich veľkosť 75x380 nm. Vírusový obal pozostáva z troch vrstiev ako to vidieť na obrázku hore. Bacilovitý, možno tiež povedať, že projektilový tvar častíc vidieť na obrázku dolu. Bielkovinový obal je veľmi silný a môže dobre chrániť infekčnú nukleovú kyselinu umiestnenú snáď v strede bacilovitej častice.
Už z predchádzajúcich obrázkov sme mohli vidieť, že vírusy nepredstavujú homogénny materiál. Majú zložitú štruktúru. Dosiaľ sme mali obrázky predstavujúce rastlinné vírusy. Povedali sme si o nich, že sú jednoduchšie než živočíšne vírusy. Pozrime sa teraz na niektoré živočíšne vírusy. Štúdium štruktúry vírusov umožnila najmä technika rezania vírusov. Vyčistený vírus alebo skúmané tkanivá sa zalejú do špeciálnych zalievacích hmôt a vyhotovujú sa z nich pomocou ultramikrotómu tenučké rezy. Väčšina živočíšnych vírusov má viac-menej guľovitý tvar. Na obrázku je schématické znázornenie jednotlivých častí takejto vírusovej častice. Viacero druhov vírusov má svoju časticu obalenú ochrannou vrstvou uzavretou v blane. Vírusová častica obalená ochranným obalom s blanou sa nazýva virión. Vlastná vírusová častica pozostáva z neinfekčného, nenákazlivého bielkovinového plášťa nazývaného kapsida. Kapsida je vytvorená z veľkého počtu bielkovinových jednotiek či kapsomer. Kapsidu si môžete predstaviť ako škrupinu orecha. V kapside je nukleové jadro. Toto obsahuje infekčnú, nákazlivú nukleovú kyselinu. U živočíšnych vírusov je to často dezoxyribonukleová kyselina. Povrch blany nie je hladký. Vystupujú z nej výbežky. Pomocou týchto výbežkov sa vírus zachytí na vnímavú bunku, ktorú neskoršie infikuje.
Ovšem nie všetky vírusy majú takúto štruktúru svojho viriónu. Na tomto obrázku vidíme schéma guľovitého vírusu, ktorý má nákazlivý bielkovinový plášť, kapsidu, vytvorenú z veľmi ohybného, slimákovite stočeného vlákna. Nákazlivá, infekčná nukleová kyselina je uložená vo vnútri kapsidy. Celý nukleokapsid je ešte chránený obalom s blanou.
Živočíšne vírusy sú spravidla väčšie a zložitejšie v tom, že obsahujú nielen jeden druh bielkoviny a jeden druh nukleovej kyseliny /ribonukleovú alebo dezoxyribonukleovú/ ale aj iné prídatné chemické zložky ako lipoidy /tukové látky/, uhlohydráty, vitamíny, enzýmy a pod. Na obrázku máme schéma vírusovej častice /bez obalu a membrány/ chrípky. Každý z nás túto chorobu pozná, neraz ju prekonal. Jej častica pozostáva z bielkovinových jednotiek /kapsomer/ akoby osadených do lipoidovej masy. Infekčný, nákazlivý nukleoproteín /ribonukleová kyselina/ je uložený vo vnútri vírusovej častice. Vedľa lipoidov sú tam ešte určité uhlohydráty a enzým sialidáza. Pokiaľ ide o zastúpenie jednotlivých zložiek tak nákazlivému nukleoproteinu patrí asi 0,8% váhy vírusovej častice, asi 30% váhy patrí lipoidom, 5% uhlohydrátom a zbytok, asi 64% plášťovej bielkovine.
Neštovice sú dnes už iba veľkou zriedkavosťou v Európe, ale ešte časté v Ázii a inde. Vírus spôsobujúci túto chorobu má zvláštny, tehličkovitý tvar a patrí tiež k veľkým vírusom. Rozmery častice sú asi 280x220x220 nm. Infekčnej nukleovej kyseline patrí asi 5,6%, bielkovinám asi 89% a lipoidom asi 5,7%. Štruktúra tehličkovitej častice je znázornená na tomto obrázku. Hore je celkový pohľad na vírusovú časticu, v strede je kolmý prierez častice, na ktorom v strede vidieť činkovite vyformovaný tvar, čo je dezoxyribonukleová kyselina a bielkoviny. Toto jadro je obalené bielkovinovým plášťom. Nad a pod stredom činky je ďalší štrukturálny element bielkovinovej povahy. Celá infekčná častica je ešte obalená ďalšou ochrannou vrstvou – membránou, ktorá pravdepodobne obsahuje lipoidy a iné zložky.
Veľmi zaujímavou skupinou vírusov sú bakteriofágy, či fágy. Sú to vírusy napádajúce baktérie. Mnohé baktérie sú pôvodcovia chorôb a tak možno povedať, že bakteriofágy sú vlastne užitočnými druhmi vírusov. Táto skupina vírusov je zaujímavá z viacerých hľadísk a vedľa vírusu mozaiky tabaku je veľmi častým pokusným objektom. Fágy sú zaujímavé tým, že všetky druhy majú dezoxyribonukleovú kyselinu a majú zvláštnu, pre nich charakteristickú stavbu svojich častíc. Sú to hlavičkovité častice. Na obrázku vidieť, že na jednom konci tyčinky je častica rozšírená a vyformovaná do tvaru hlavičky. Bližšiu stavbu častíc fágov nám predstavuje ďalší obrázok.
Hlavička vírusu má v priereze šesťuholníkový tvar a jej steny uzavierajú v sebe nákazlivú, infekčnú dezoxyribonukleovú kyselinu. Hlavička prechádza do rúrkovitého, v strede dutého chvostíka. Na bázy chvostíka sú akoby chapadlá alebo nožičky ukončené dlhými vláknami. Bakteriofág prisadne na baktériu vždy bázou chvostíka, svojimi nožičkami a vláknami sa na baktériu uchytí a po krátkom čase začne proces infekcie. Bakteriofág stlačí svoj chvostík a postupne vytláča cez stlačený chvostík nákazlivú dezoxyribonukleovú kyselinu von z hlavičky až prejde všetko do baktérie. DNK navedie v baktérii svoje rozmnoženie a tvorbu plášťovej bielkoviny. Po vyčerpaní stavebného materiálu baktérie dochádza k rozpadu, roztečeniu lýzie baktérie, pričom sa nové fágy dostávajú von z baktérie. Infekčný proces sa môže opakovať na iných zdravých baktériách.
Na tomto unikátnom obrázku sa podarilo zachytiť vlákno nákazlivej detoxyribonukleovej kyseliny, uvoľnené z hlavičky bakteriofágu. Jemnosť a dĺžka vlákna je prekvapujúca, ak si uvedomíme neobyčajne malé rozmery vírusov. Ani objaviteľ vírusov Ivanovskij, ani nikto z vás si asi nepredstavoval vírusy tak, ako ste ich videli na obrázkoch. Aj keď sú nepatrné, superdrobné, predsa majú ešte zložitú a veľmi zaujímavú, presne podľa určitých zákonov stavanú štruktúru svojej častice. Napriek tomu, že sú vírusy len veľmi nepatrných rozmerov, že sa ich do mm vmestí tisíce, že ich častice možno vidieť len v elektrónovom mikroskope, predsa môžeme povedať, že sú pomerne bohaté na tvary, že sú to ešte dosť zložité útvary prírody. Majú svoje zákony stavby, geneticky fixovanú skladbu a štruktúru, bohatú paletu druhov a kmeňov, ktoré možno na základe určitých kritérií rozdeliť do rôznych skupín. Všetky však potrebujú pre svoju aktivitu a rozmnožovanie živé bunky a sú pôvodcami chorôb.
